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DNA提取試劑盒的原理是什么?

 更新時間:2023-10-09 點擊量:1077

如今,大多數(shù)實驗室都使用商業(yè) DNA 提取試劑盒,這些試劑盒使用硅膠自旋過濾法來獲得高質(zhì)量的 DNA。這些可以快速有效地純化 DNA(或 RNA)。那么DNA提取試劑盒的原理是什么呢?讓我們一起來看看吧!

一、RNA和DNA提取

裂解:裂解公式可能因您要提取 DNA 還是 RNA 而異,但共同點是含有高濃度離液鹽的裂解緩沖液。

Chaotropes(離液劑)的作用:Chaotrope會破壞氫鍵及疏水間的相互作用。離液鹽包括鹽酸胍、硫氰酸胍、尿素和高氯酸鋰。

洗滌劑:除了離液劑外,裂解緩沖液中通常還有一些去污劑,以幫助蛋白質(zhì)溶解和裂解。

溶菌酶和蛋白酶K:根據(jù)樣品類型,也可以使用酶進行裂解。蛋白酶 K 就是其中之一,實際上在這些變性緩沖液中效果較好;當?shù)鞍踪|(zhì)變性增多,蛋白酶 K 的作用也會相應(yīng)增強。然而,溶菌酶在變性中不起作用,因此溶菌酶處理通常在添加變性鹽之前進行。

二、關(guān)于質(zhì)粒制備的注意事項

分離質(zhì)粒 DNA 與提取 RNA 或基因組 DNA 的提取方式是不相同的,因為必須質(zhì)粒與基因組 DNA 必須分離。如果此刻,您加入離液劑將立即釋放所有物質(zhì),并且無法將小環(huán)狀 DNA 與高分子量染色體區(qū)別開來。因此,在質(zhì)粒制備過程中中,直到裂解后才加入離液劑,鹽用于結(jié)合。

三、DNA 提取后純化:將 DNA 與色譜柱結(jié)合

離液鹽對于裂解至關(guān)重要,而且對于將 DNA(或 RNA)與色譜柱結(jié)合也是如此。此外,為了增強和影響核酸與二氧化硅的結(jié)合,還添加了酒精。

大多數(shù)情況下這是乙醇,但有時可能是異丙醇。乙醇百分比和體積有很大的影響。太多,你會帶入大量降解的核酸和小物種,這會影響 A260 讀數(shù)并降低你的一些產(chǎn)量。太少,可能難以從膜上洗掉所有鹽分。

如果您在裂解中使用含有 SDS 的去污劑,請嘗試使用NaCl 作為沉淀劑,以避免去污劑污染 DNA 或 RNA。

四、洗滌 DNA(或 RNA)

當裂解物通過硅膠膜進行離心分離,現(xiàn)在所提取的 DNA 或 RNA 應(yīng)該與柱子結(jié)合,雜質(zhì)、細胞蛋白和多糖應(yīng)該已經(jīng)通過了。

但是,膜仍然被殘留的細胞蛋白質(zhì)和鹽弄臟。如果樣品來自植物,仍然會有多糖,也許一些色素留在膜上,或者如果樣品是血液,膜可能會被染成棕色或黃色。

洗滌步驟用于去除這些雜質(zhì)

通常有兩次洗滌,盡管這可能因樣品類型而異。第一次洗滌通常會含有少量的離液鹽,以去除蛋白質(zhì)和有色污染物。這之后總是用乙醇洗滌以除去鹽。

如果開始的準備工作沒有大量蛋白質(zhì),例如質(zhì)粒準備或 PCR 清理,則只需要乙醇洗滌。去除離液鹽對于獲得高產(chǎn)量和高純度的 DNA 或 RNA 至關(guān)重要。一些試劑盒甚至會用乙醇清洗柱子兩次。

如果殘留鹽分,核酸的洗脫會很差,A230讀數(shù)會很高,導致260/230的比率很低。對于無乙醇 DNA 和 RNA,需要進行干法離心,乙醇洗滌后,大多數(shù)方案都有一個離心步驟來干燥柱子。這是為了去除乙醇,對于清潔的洗脫液是bi不可少的。

當將 10 mM Tris 緩沖液或水應(yīng)用于膜進行洗脫時,核酸會水合并從膜中釋放出來。如果色譜柱上仍有乙醇,則核酸無法wan全再水合。如果跳過干燥步驟會導致乙醇污染和低產(chǎn)量。很可能在 Nanodrop 上看不到乙醇吸光度,所以它不會出現(xiàn)在您的讀數(shù)中。

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